PGD - PGDON'T
PGD, PGDon't.....what every clinician should know about pgd
Τι είναι η Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση;
Διαδικασία
Νομοθετικές ρυθμίσεις
βιβλιογραφία
Τι είναι η Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση;
Υπάρχουν δύο μέθοδοι να ελένξουμε γενετικά ένα έμβρυο πριν από την εμβρυομεταφορά του στη γυναίκα: α) η Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (Prenatal Genetic Diagnosis, PGD) και ο Προεμφυτευτικός Γενετικός Έλεγχος (Prenatal Genetic Screening, PGS).
Εξωσωματική Γονιμοποίηση
| Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (PGD) | Προεμφυτευτικός Γενετικός Έλεγχος (PGS)
|
| Polymerase Chain Reaction PCR «Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης» |
Fluorescent In Situ Hybridization, FISH «In Situ Υβριδοποίησης με Φθορισμό» |
| Εντοπισμό μονογονιδιακών κληρονομικών ασθενειών | Διάγνωση ανευπλοειδιών (ανωμαλιών στον αριθμό των χρωμοσωμάτων) χρωμοσωμικών μετατοπίσεων |
| Κυστική ίνωση / Μεσογειακή αναιμία | Ανευπλοειδίες σε πέντε μόνο χρωμοσώματα ταυτοχρόνως (Χ,Υ,13,18,21) Επιλογή φύλου
|
| Τμήμα Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Παίδων «Αγία Σοφία» | Τμήμα Ιατρικής Γενετικής Alpha Lab/ Λητο |
| Τμήμα Ιατρικής Γενετικής Alpha Lab/ Λητο | |
Ορισμοί
Με τον όρο «Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση» (PGD), εννοούμε τη διαδικασία εντοπισμού μονογονιδιακών γενετικών ασθενειών, ώστε στη συνέχεια να επιλεχθούν και να μεταφερθούν στη γυναίκα τα υγιή μόνο έμβρυα που αποκτήθηκαν με την μέθοδο της Εξωσωματικής Γονιμοποίησης.
Με τον όρο «Προεμφυτευτικός Γενετικός Έλεγχος» (PGS), εννοούμε τη διαδικασία που εφαρμόζεται για την διάγνωση ανευπλοειδιών, δηλαδή ανωμαλιών στον αριθμό των χρωμοσωμάτων (π.χ. τρισωμία 21 ή σύνδρομο Down) αλλά και χρωμοσωμικών μετατοπίσεων, προκειμένου στη συνέχεια να γίνει επιλογή και εμβρυομεταφορά υγιών εμβρύων που αποκτήθηκαν με τη μέθοδο της Εξωσωματικής Γονιμοποίησης.
Ο κύκλος της PGD αλλά και του PGS είναι ακριβώς ίδιος με εκείνον της Εξωσωματικής Γονιμοποίησης, με τη διαφορά ότι την τρίτη ημέρα μετά την ωοληψία πραγματοποιείται βιοψία των εμβρύων (δηλαδή λήψη βλαστομεριδίου(ων) από το έμβρυο με τη χρήση μικροχειριστικών μεθόδων).
Γιατί χρησιμοποιείται η PGD και το PGS
Οι λόγοι για τους οποίους αρχικά δημιουργήθηκε η ανάγκη να εφαρμοστεί η μέθοδος της PGD είναι οι παρακάτω, αν και όπως θα δούμε αργότερα, πολλοί από αυτούς έχουν εκκλείψει.
1. Να εξαλειφθεί ο κίνδυνος για εκείνα τα ζευγάρια που κινδυνεύουν να μεταδώσουν στα παιδιά τους κληρονομικά νοσήματα.
2. Να μειώσουμε το χρονικό διάστημα των δώδεκα εβδομάδων που πρέπει το ζευγάρι να περιμένει για να υποστεί προγενετικό έλεγχο (Prenatal Diagnosis).
3. Να αποφύγουμε την ψυχολογική φθορά που μπορεί να προκληθεί ύστερα από μια αναγκαστική διακοπή κύησης εμβρύων που είναι φορείς γενετικών ανωμαλιών.
Ειδικά για την περίπτωση του PGS, ο βασικός λόγος εφαρμογής του είναι η αύξηση των ποσοστών εγκυμοσύνης, εφόσον αποφεύγονται τα έμβρυα που φέρουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Όπως είναι ήδη γνωστό, ένα υψηλό ποσοστό ωαρίων και εμβρύων φέρει χρωμοσωμικές ανωμαλίες, με αποτέλεσμα και το ποσοστό εμφύτευσής τους να είναι χαμηλό (Placot et al., 1990).
Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται ενίοτε και στις περιπτώσεις που έχουν σημειωθεί πολλαπλές αποτυχημένες προσπάθειες Εξωσωματικής Γονιμοποίησης καθώς και αποβολές.
Οι προαναφερθείσες τεχνικές δεν είναι ιδιαίτερα καινούργιες. Τα πρώτα παιδιά, που σαν έμβρυα είχαν υποστεί βιοψία για να πιστοποιηθεί το φύλο τους και να αποφεχθεί έτσι η μετάδοση φυλοσύνδετου νοσήματος, γεννήθηκαν στο Hammersmith το 1989 (Handyside, 1989).
Οι βασικές αρχές της PGD και του PGS
Η PGD χρησιμοποιεί την τεχνική της «Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης» (Polymerase Chain Reaction, PCR) για τον εντοπισμό μονογονιδιακών κληρονομικών ασθενειών, όπως η κυστική ίνωση και η μεσογειακή αναιμία. Εν συντομία, με την τεχνική της PCR, το DNA που έχει προηγουμένως απομονωθεί με κατάλληλα πρωτόκολλα (στην περίπτωσή μας από ένα μόνο κύτταρο μέσω της βιοψίας) αντιγράφεται σε πολλαπλά αντίγραφα, ώστε η ποσότητά του να γίνει ανιχνεύσιμη.
Το PGS χρησιμοποιεί την τεχνική της «In Situ Υβριδοποίησης με Φθορισμό» (Fluorescent In Situ Hybridization, FISH), σύμφωνα με την οποία χρησιμοποιούνται χρωμοσωμο-ειδικοί φθορίζοντες δείκτες. Μάλιστα, με την τεχνική του πολυχρωματικού FISH είναι εφικτός ο ταυτόχρονος προσδιορισμός του φύλου, ανευπλοειδιών και χρωμοσωμικών μετατοπίσεων.
Σήμερα, με την τεχνική του PGS μπορούμε να διαγνώσουμε ανευπλοειδίες σε πέντε μόνο χρωμοσώματα ταυτοχρόνως (Munne, 1999), αν και η επιλογή του συνδυασμού τους είναι συζητήσιμη (Bahce, 1999). Τα περισσότερα πάντως Κέντρα ελέγχουν τα χρωμοσώματα 21,18, 13, X,Y.
Πρέπει εδώ να να τονιστεί ότι η PGD και o PGS είναι δύο διαφορετικές τεχνικές που απαιτούν εντελώς διαφορετικό εργαστηριακό εξοπλισμό αλλά και κατάλληλα εκπαιδευμένο επιστημονικό προσωπικό. Συγκεκριμένα, χρειάζεται η ειδικότητα του Μοριακού Γενετιστή για την εφαρμογή της PCR και του Κυτταρογενετιστή για την εφαρμογή του FISH.
Τα προηγούμενα τέσσερα χρόνια, όπως δείχνει η επίσημη έκθεση της PGD(S) Ομάδας Εργασίας της ESHRE (Εuropean Society for Human Reproduction and Embryology), από τους 1337 PGD κύκλους το ποσοστό εγκυμοσύνης έφτασε to 19%, ενώ από τους 801 PGS κύκλους το αντίστοιχο ποσοστό ήταν 20% (Sermon, 2005).
To PGD δεν είναι μια διαδικασία ρουτίνας, και απαιτεί τη συνεργασία πολλών διαφορετικών ειδικοτήτων. Γι' αυτό πιθανόν να υπάρχει κάποια χρονική καθυστέρηση(λίστα αναμονής), ώστε να υπαρχει ο απαραίτητος συντονισμός.
Γενετική Συμβουλευτική
Έλεγχος μεταλλάξεων (αίμα)
Εξωσωματική Γονιμοποίηση
Βιοψία εμβρύων
Γενετική ανάλυση (PCR/FISH)
Εμβρυομεταφορά
Προγενετικός έλεγχος
Γενετική Συμβουλευτική
Απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή τόσο της PGD όσο και του PGS είναι το ζευγάρι να έχει προηγουμένως συμβουλευτεί κατάλληλο Γενετιστή και ο οποίος θα κρίνει κατά πόσο αυτές οι τεχνικές ενδείκνυνται για την περίπτωσή τους.
Έλεγχος αίματος ζευγαριού για τον τύπο των μεταλλάξεων
Αρχικά λαμβάνεται δείγμα αίματος και από τους δύο ενδιαφερομένους, προκειμένου να γίνει ένας αρχικός έλεγχος για τη μεσογειακή αναιμία, κυστική ίνωση, φυλοσύνδετες ασθένειες και ανευπλοειδίες, με σκοπό να διαπιστωθεί εάν οι προαναφερθείσες μεταλλάξεις είναι εντοπίσιμες με τις υπάρχουσες τεχνικές. Στην περίπτωση που μπορεί να ανιχνευθεί η μετάλλαξη, το ζευγάρι παραπέμπεται σε Μονάδα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης και η γυναίκα λαμβάνει ορμόνες για την επαγωγή της ωορηξίας. Υπάρχει όμως και η περίπτωση η συγκεκριμένη μετάλλαξη να μην είναι ανιχνεύσιμη. Για αυτά τα ζευγάρια χρειάζεται να πραγματοποιηθεί μια σειρά πειραμάτων σε έμβρυα που έχουν δωρηθεί για ερευνητικούς σκοπούς, ώστε να διαπιστωθεί κατά πόσο μπορεί να εντοπισθεί η μετάλλαξη έχοντας διαθέσιμο ένα μόνο κύτταρο (βλαστομερίδιο). Εάν τα πειράματα είναι επιτυχή, τότε και αυτά τα ζευγάρια παραπέμπονται σε Μονάδα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης.
Εξωσωματική Γονιμοποίηση
Το ζευγάρι που θα παραπεμφθεί για κύκλο PGD/PGS - Εξωσωματικής Γονιμοποίησης θα υποβληθεί στις κλασσικές διαδικασίες της Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής (ICSI), με τη διαφορά ότι ένας τέτοιος κύκλος θα πρέπει να ξεκινήσει με τουλάχιστον 9 ωοθηλάκια (ESHRE Working Group on PGD και Liebers et al, 1998). Σε αντίθετη περίπτωση μπορεί να ακυρωθεί ο κύκλος.
Βιοψία εμβρύων
Την τρίτη μέρα μετά την γονιμοποίηση και μόνο στην περίπτωση που τα έμβρυα είναι καλής ποιότητας, πραγματοποιείται βιοψία σε κάθε ένα από τα διαθέσιμα έμβρυα με την λήψη βλαστομεριδίου(ων) από κάθε ένα από αυτά. Στη συνέχεια το βλαστομερίδιο(α) μεταφέρεται σε κατάλληλο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής όπου και θα γίνει η διάγνωση.
Γενετική ανάλυση
Εφόσον πραγματοποιηθεί η PGD ή το PGS, τα αποτελέσματα ανακοινώνονται στο Εργαστήριο Εμβρυολογίας της Μονάδας Εξωσωματικής Γονιμοποίησης, ώστε να επιλεχθούν τα υγιή έμβρυα για εμβρυομεταφορά.
Προγενετικός έλεγχος
Παρ?ολ?αυτά, επειδή έχουν σημειωθεί περιπτώσεις λανθασμένης διάγνωσης (Sermon. 2005), είναι απαραίτητη η χρησιμοποίηση της μεθόδου του Προγενετικού Ελέγχου ώστε να διαπιστωθεί η υγεία του νεογνού.
Μέθοδοι ανίχνευσης
1) PGS (Pre-implantation Genetic Screening) με τη χρήση της FISH τεχνικής για την ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών.
Ανωτέρω φαίνονται οι χρωμοσωμο-ειδικοί φθορίζοντες δείκτες που καταδεικνύουν τρισωμία 21 (3 κόκκινα σημεία) σε ένα βλαστομερίδιο.
2) PGD (Pre-implantation Genetic Diagnosis) με τη χρήση της τεχνικής PCR (Polymerase Chain Reaction) για την ανίχνευση μονογενετικών ανωμαλιών.
Ανωτέρω φαίνεται πηκτή (gel) αγαρόζης με τις χαρακτηριστικές για την ασθένεια της μεσογειακής αναιμίας μεταλλάξεις, μετά από χρήση PCR σε έναν PGD κύκλο. Τα δείγματα εμβρυϊκού DNA αντιστοιχούν στις σειρές 2 έως 9.
Η νομοθεσία στην ερευνά των ανθρωπίνων εμβρύων καθώς και στην προεμφυτευτικη διάγνωση, διαφέρει από κράτος σε κράτος.
Σε κάποια κράτη όπως η Μεγάλη Βρετανία, οι κανόνες για έρευνα έχουν ρυθμιστεί από μία επιτροπή (ΗFEA: Οργανισμός εμβρυολογίας & ανθρώπινης γονιμοποίησης) ενώ σε κάποιες άλλες χώρες όπως η Γαλλία μόλις πρόσφατα έχει επιτραπεί η προεμφυτευτικη διάγνωση.
Η ΗFEA είναι μια νόμιμη ανεξάρτητη επιτροπή έλεγχου, αποτελούμενη από επιστήμονες και ηθικολόγους που κάνουν αναφορά στο υπουργείο Υγείας. Βάζει πίεση στους επιστήμονες να αιτιολογούν τι είναι απαραίτητο να γίνεται και τι επιθυμητό.
Οι ΗΠΑ έχουν την Εθνική Βιοηθική Συμβουλευτική Επιτροπή η οποία συμβουλεύεται τον Πρόεδρο, χωρίς όμως να είναι επίσημα αυστηρός οργανισμός.
Στην Ελλάδα, ψηφίστηκε για πρώτη φορά σχετικό νομοσχέδιο στις 10 Δεκεμβρίου 2002.
1)Ιατρική υποβοήθηση στην ανθρώπινη αναπαραγωγή ν,3089/2002
Άρθρο 1455
Η ιατρική υποβοήθηση στην ανθρώπινη αναπαραγωγή (τεχνιτή γονιμοποίηση) επιτρέπεται μόνο για να αντιμετωπίζεται η αδυναμία απόκτησης τέκνων με φυσικό τρόπο ή για να αποφεύγεται η μετάδοση στο τέκνο σοβαρής ασθένειας. Η υποβοήθηση αυτή επιτρέπεται μέχρι την ηλικία φυσικής ικανότητας αναπαραγωγής του υποβοηθούνενου προσώπου. Η ανθρώπινη αναπαραγωγή με τη μέθοδο της κλωνοποίησης απαγορεύεται.
Επιτρέπεται η προεμφυτευτικη διάγνωση μόνο όταν πρόκειται για κληρονομικές ασθένειες και η επιλογή φύλου μόνο για περιπτώσεις φυλοσύνδετων ασθενειών
2) Προσχέδιο νόμου «Εφαρμογή των μεθόδων Ιατρικώς Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής»
Aρθρο 10
Προεμφυτική γενετική διάγνωση
1. Η προεμφυτική διάγνωση διενεργείται με τη συναίνεση των ενδιαφερόμενων προσώπων και με την άδεια της Αρχής, για να διαγνωσθεί αν τα γονιμοποιημένα ωάρια είναι φορείς γενετικών ανωμαλιών, ώστε να αποτραπεί η μεταφορά τους στη μήτρα. Η εν λόγω άδεια χορηγείται, αφού διαπιστωθεί ότι η Μ.Ι.Υ.Α. διαθέτει την αναγκαία τεχνογνωσία και τον απαιτούμενο εξοπλισμό ή συνεργάζεται με αντίστοιχη ομάδα ή εργαστήριο, το οποίο πληρεί τις προϋποθέσεις αυτές.
2. Πριν από την εφαρμογή της μεθόδου είναι υποχρεωτική η παροχή γενετικής συμβουλευτικής στα ενδιαφερόμενα πρόσωπα.
Bahce, M.,Cohen, J.and Munne, S. (1999) PGD for aneuploidy. J. Assist. Reprod. Genet., 16, 176-181
Egozcue, J. (1996) Preimplantation diagnosis in older women. To biopsy or not biopsy? Of course not. Hum. Reprod., 11, 2077-2078.
ESHRE (2002) ESHRE Preimplantation genetic diagnosis consortium data collection III. Hum. Reprod., 17, 233-246.
Harper, J.C. and Delhandy, J.D.A. (1996) diction of chromosomal abnormalities in human preimplantation embryos using FISH. J. Assist. Reprod. Genet., 13, 137-139
Handyside, A.H., Penketh, R.J.A., Winston, R.M.L et al (1989) Biopsy of preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet, i, 347-381.
Kanavakis E., Vrettou X., Palmer G., et al. (1999) Preimplantation Genetic Diagnosis in 10 couples at risk for transmitting B-thalassaemia Major. Prenat. Diagn. 19, 1217-1222.
Kermon, K., Moutou, C., Geraedts, J et al. IV (2005) ESHRE Preimplantation genetic diagnosis consortium data collection. Hum. Reprod., 20, 19-34.
Liebers, I., Sermon, K., Staessen, C., et al (1998) Clinical experience with preimplation genetic diagnosis. Hum. Reprod., 13, 186-195.
Palmer, G. A. and Harper, J. (2000) The Dificulties in PGD . Preimplantation Genetic Diagnosis.The Pan Hellenic society for Clinical Embryologists, Caravel, Athens.
Palmer G., Traeger-Synodinos, J, Kanavakis E., et al. (2002) Pregnancies following blastocyst stage transfer in PGD cycles at risk for B-thalassaemic haemoglobinopathies. Hum. Reprod., 17, 25-31.
Placot, M. and Manddelbaum, J. (1990) Oocyte maturation, fertilization and embryonic growth in vitro. Br. Med. Bull., 46, 675-694
Munne, S., Magli, C., Cohen, J. et al (1999) Positive outcome after preimplantation diagnosis of aneuploidy. Hum. Reprod., 14, 2191-2199
Ray, R.F. and Handyside, A. H. (1996) Increasing the denaturing temperature during the first cycles of amplification reduces allele drop out. Mol. Hum. Reprod. 2, 213-218.
Vrettou X., Palmer G., Kanavakis E., et al. (1999) A widely applicable strategy for single cell genotyping of B-thalassaemia mutations using DGGE analysis. Prenat. Diagn. 19, 1209-1216.
