FUTURE IVF
FUTURE IVF- Giles Palmer:Το 1978 όταν ο Robert Edwards και ο Patrick Steptoe ανακοίνωσαν την γέννηση του πρώτου παιδιού μέσω εξωσωματικής γονιμοποίησης σε ένα νοσοκομείο ενός μικρού χωριού στο Oldham, μια παγκόσμια βιομηχανία γεννήθηκε. Ενώ στην αρχή συνίστατο για την θεραπεία προβλημάτων υπογονιμότητας που σχετίζονται με τις σάλπιγγες στην συνέχεια συσχετίστηκε και με γενετικές και αναπαραγωγικές διαταραχές ,γεννώντας κοινωνικά, ηθικά, νομικά και θρησκευτικά ζητήματα. Ο εκκολαπτόμενος τομέας της εμβρυολογίας έχει εξελιχθεί, οι Τεχνολογίες της Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής (ART) έχουν προοδεύσει, η εμπειρία έχει αποκτηθεί και οι τεχνολογίες τελειοποιούνται.
Ζούμε σε μια κοινωνία που ποτέ πριν επιστημονικά δεδομένα δεν ήταν τόσο προσιτά και δεν διαδίδονταν τόσο γρήγορα. Οι εξελίξεις στο μέλλον θα οφείλονται σε αναδυόμενους πολλαπλούς επιστημονικούς τομείς. Οι προόδοι των βιολογικών επιστημών, της βιοτεχνολογίας, της βιο-μηχανικής και της πληροφορικής συγκλίνουν για να δημιουργήσουν νέες καινοτομίες: πολλές από τις οποίες έχουν άμεση συνάφεια με τον τομέα της ART , και μερικές από αυτές είναι στο χείλος της υλοποίησης. Παρακάτω είναι λίγες από τις νέες εξελίξεις στον ορίζοντα.
Περισσότερες εξελίξεις στα καλλιεργητικά υλικά
Αυξητικοί παράγοντες
Τα καλλιεργητικά υλικά που χρησιμοποιούνται για τα ανθρώπινα έμβρυα έχουν βελτιωθεί σημαντικά, αρχικά αποτελούνταν από ρυθμιστικά διαλύματα αλάτων ή από υλικά κατασκευασμένα από ουσίες που ήταν ευρέως γνωστό ως εκείνη την εποχή ότι βρισκόταν στις σάλπιγγες.(1 ). Αυτά τα σκευάσματα ήταν αποτελεσματικά αλλά οι προσπάθειες καλλιέργειας στο στάδιο της βλαστοκύστης ήταν ανεπιτυχείς, παρόλα αυτά, αν και ένας αριθμός εμβρύων έφτασε σε αυτό το στάδιο, η βιωσιμότητα αυτών των εμβρύων σχετίστηκε με χαμηλά ποσοστά εμφύτευσης. (2). Σήμερα τα περισσότερα εργαστήρια IVF χρησιμοποιούν διαδοχικά υλικά που βασίζονται στις αλλαγές των ενεργειακών απαιτήσεων και στις βασικές αρχές φυσιολογίας που αναγνωρίστηκαν από τους Leese (3), Quinn (4) και Gardner (5). Η ανάπτυξη του ανθρώπινου εμβρύου in vitro είναι βέλτιστη με λιγότερα κύτταρα και μειωμένο ποσοστό ανάπτυξης (6). Στο φως των επιδημιολογικών μελετών που δειχνούν βλάβη στην αύξηση και την μετα-ανάλυση των φτωχών περιγεννητικών αποτελεσμάτων (7) είναι επιτακτική ανάγκη να προσπαθήσουμε την συνέχεια ανάπτυξης σκευασμάτων καλλιεργητικών υλικών.
Εικόνα 1: GM-CSF μόριο
Υπό ανάπτυξη είναι μια νέα γενιά καλλιεργητικών υλικών που περιέχουν βιοδραστικά συστατικά ώστε να προσωμοιάζουν περισσότερο τα υγρά της σάλπιγγας και της μήτρας. Αυξητικοί παράγοντες παρόντες στο γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα δείχνουν να προωθούν την εμβρυική ανάπτυξη και την μετά- εμφυτευτική ικανότητα (8), και ένας τέτοιος παράγοντας είναι ο granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) που συνιστά την δέουσα προσοχή. Ο GM-CSF είναι μια κυτοκίνη που ενεργεί θετικά στον αριθμό των κυττάρων, στην εμφύτευση και στην ανάπτυξη της ανθρώπινης βλαστοκύστης (9). Ασκεί την επίδρασή του προσδενόμενος στους υποδοχείς του που είναι παρόντες στα ωοκύτταρα και στα έμβρυα, συμμετέχοντας στην ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και την βιωσιμότητα των εμβρύων (10). Άλλες μελέτες έχουν επιπλέον προτείνει οτι ο GM-CSF ρυθμίζει την απόπτωση (11; 12 ), και αναστέλλει την απόκριση του κυτταρικού stress.
Μια πρόσφατη δουλειά από τον Sjoblom (13) σε έμβρυα μυών έδειξε οτι ο GM-CSF όχι μόνο μειώνει τις δυσμενείς επιδράσεις των συνθηκών καλλιέργειας, αλλά έδειξε οτι ο GM-CSF είναι σημαντικός στον φυσιολογικό πλακούντα και στην ανάπτυξη του εμβρύου. Μια τέτοια δουλειά παρουσιάζει τους περιορισμούς στα υπάρχοντα καλλιεργητικά υλικά στο να παράγουν ένα υπολειτουργικό πλακουντικό περιβάλλον, δίχως την παρουσία κατάλληλων θρεπτικών και ρυθμιστικών παραγόντων in vitro. Ανησυχίες σχετικά με την αναμενόμενη εισαγωγή των παραγόντων αυτών θα πρέπει να μετριαστούν λόγω της καθορισμένης απαραίτητης συγκέντρωσης, αλλά και με τα κατάλληλα χαμηλά επίπεδα αυξητικών παραγόντων, όπως είναι γνωστοί οτι υπάρχουν in vivo, είναι απίθανο η εισαγωγή τους να είναι επιβλαβής στην ανθρώπινη εμβρυική ανάπτυξη.
Υπάρχουν πολλοί άλλοι πιθανοί ρυθμιστικοί παράγοντες παρόντες στο περιβάλλον του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος που είναι πιθανοί υποψήφιοι για έγκλειση της νέας γενιάς ART υλικών που θα σχεδιαστούν για να προωθήσουν την βέλτιστη ανάπτυξη in vitro και την εμβρυική ανάπτυξη μετά την εμφύτευση.
Δυναμική καλλιέργεια εμβρύων
Τα στατικά καλλιεργητικά υλικά που δουλεύουμε σήμερα συγκρίνονται ελάχιστα με το μικρο-περιβάλλον του γονιμοποιημένου ωοκυττάρου. Από την σύλληψή της, η εξωσωματική γονιμοποίηση διεξάγεται σε σωληνάκια από πολυστυρένιο και τρυβλία με καλλιεργητικό υλικό. Κοινές καλλιέργειες εξάσκησης ίσως να επιτρέπουν την συσσώρευση τοξικών συστατικών όπως η αμμωνία (14) και ελεύθερων ριζών (15) που μπορεί να είναι επιβλαβείς για τα έμβρυα. Η μεταφορά εμβρύων σε ‘φρέσκο’ καλλιεργητικό υλικό ίσως να μειώσει τέτοιες επιδράσεις αλλά παράλληλα αφαιρεί και τους αυτοκρινώς και παρακρινώς εκκρινόμενους παράγοντες που είναι ευεργετικοί για το έμβρυο (16) .
Νέες προσπάθειες μίμησης της δυναμικής του αναπαραγωγικού συστήματος έχουν δώσει μερικά ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Η έκθεση των εμβρύων σε μηχανικά ερεθίσματα έχει βελτιώσει την ανάπτυξη εμβρύων τόσο μυών όσο και ανθρώπου (17) και αύξησε την ανάπτυξη στο στάδιο της βλαστοκύστης μετά απο ωρίμανση in vitro (IVM) ωαρίων από χοίρους (18) μέσω υποβολής της καλλιέργειας των εμβρύων σε διαδικασίες όπως η συμπίεση και η δύναμη τριβής που τα έμβρυα υφίστανται στο αναπαραγωγικό σύστημα.
Μια άλλη πολλά υποσχόμενη προσέγγιση είναι η χρήση των ‘Microfluidics’ τα οποία έχουν πολλές εφαρμογές στη χημική μηχανική και στην γενετική (19), και μπορεί να υποσχεθούν πολλά στην ART. Αυτή η εκκολαπτόμενη τεχνολογία αξιοποιεί τα χαρακτηριστικά των κίνησεων των υγρών μέσα σε μίκρο- και νάνο-περιβάλλοντα με το να παρέχουν πολλαπλές ροές υλικών στο ίδιο μικρο-κανάλι. Αυτό το «εργαστήριο-τσιπ» έχει πρωτίστως μικροσκοπικά κανάλια, πύλες και αντλίες που κατευθύνουν την ροή των υγρών και είναι ένα εξαίρετο παράδειγμα για το πως η βιοτεχνολογία εισέρχεται στην σφαίρα της ART.
Τα microfluidics έχουν δυνητικά ευρεία εφαρμογή στον τομέα της ART. Οι συγκαλλιέργειες χρησιμοποιώντας έμβρυα χωρισμένα από τα κύτταρα του ενδομητρίου, μέσω μιας λεπτής μεμβράνης από polyester ,τόσο σε εμβρυικές καλλιέργειες μυών όσο και σε καλλιέργειες ανθρώπινων εμβρύων ( 20, 21) δημιουργούν ένα συνεχές σύστημα ροής.Τα μικροκανάλια παρέχουν την δυνατότητα να έρθουν τα ωοκύτταρα και τα σπερματοζωάρια σε κοντινή απόσταση, παρέχοντας πιο ευνοϊκές συνθήκες για γονιμοποιήση με χαμηλότερες συγκεντρώσεις σπέρματος (22), κάτι που δυνητικά θα βελτίωνε την αποδοτικότητα με την γονιμοποίηση των ωαρίων.
Κατά την διαδικασία δημιουργίας ενός συστήματος καλλιέργειας που θα μιμείται το φυσικό και δυναμικό περιβάλλον των εμβρύων, έχει προταθεί οτι θα πρέπει να γίνει μια μείωση της εντοπισμένης πίεσης του οξυγόνου αλλά και να αφαιρεθούν οι επιβλαβείς τοξίνες. Μια τέτοια κίνηση ίσως να βοηθήσει την υποδεκτικότητα των υποδοχέων ή να διεγείρει τα μονοπάτια σηματοδότησης που προωθούν μια βελτιωμένη ανάπτυξη της καλλιέργειας (23).
Οι Microfluidic συσκευές έχουν κατασκευαστεί από ποικιλία υλικών, αλλά πιο πρόσφατα έχει επιλεγεί η polydimethylsiloxane [PDMS] λόγω της βέλτιστης μηχανικής και οπτικής ιδιότητας της, της υψηλής διαπερατότητας στα αέρια και της βιοσυμβατότητας της (24). Το ενδιαφέρον κέρδισε ο τύπος άντλησης συστήματος ‘Braille pin’ , που είναι λιγότερο πολύπλοκος και πιο συμβατικός απο τα υπόλοιπα μοντέλα (Fig. 2). Ο έλεγχος γίνεται μέσω υπολογιστή, έχει μικροσκοπικές πιεζοηλεκτρικές καρφίτσες που χρησιμοποιούνται για την παραμόρφωση των μικροκαναλιών σε μια ελατή microfluidic συσκευή, μειώνοντας την ανάγκη για αντλίες και σωλήνες σύνδεσης (25). Ο Heo και οι συνεργάτες του πρόσφατα χρησιμοποιήσαν αυτή την τεχνολογία ώστε να ανανεώσουν τα υλικά που περιέβαλλαν τα έμβρυα μυών με ένα φυσιολογικο,παλλόμενο τρόπο και ανέφεραν αυξημένη ,ανάπτυξη των εμβρύων στο στάδιο της βλαστοκύστης, αυξημένα ποσοστά εμφύτευσης και εγκυμοσύνης που πλησιάζουν τα δεδομένα in vivo (26).
 |
Εικόνα 2. Συσκευή Microfluidic A= SMART, η συσκευή καλλιέργειας εμβρύων B= SMART, η μηχανική μονάδα, C= SMART συσκευή τοποθετημένη στην μηχανική μονάδα. Το σύστημα αυτό τοποθετείται στον επωαστή και συνδέεται με το λογισμικό ενός υπολογιστή που είναι η μονάδα ελέγχου. Οι εικόνες και οι περιγραφές παρέχονται ευγενικά από τον Καθηγητή Gary D. Smith, Incept Biosystems, and Origio |
Οι μελλοντικές συσκευές μπορούν να διευκολύνουν τον αυτοματισμό της καλλιέργειας εμβρύων, παρέχοντας ένα κλειστό, multi-step σύστημα καλλιέργειας, χωρίς την ανάγκη χειροκίνητης διαχείρησης του εμβρύου.
Έχουν σχεδιαστεί ήδη κάποια μοντέλα που είναι ικανά να παρέχουν την φυσική διαχείρηση των εμβρύων μέσω αλλαγών στην ροή των υλικών. Αξιοποιώντας τις αλλαγές της περισταλτικής πίεσης και την ηλεκτρική περιστροφή, το ωοκύτταρο μπορεί να ακινοτοποιηθεί λόγω αναρρόφησης μέσω μικροσκοπικών οπών με τον ίδιο τρόπο που γίνεται ΚΑΙ με την συμβατική holding pipette που κρατά ένα ωοκύτταρο κατά την διάρκεια του ICSI (27). Μια άλλη συσκευή παρέχει ταυτόχρονα ακινητοποίηση και γονιμοποίηση του ωοκυττάρου, αφαιρώντας τα κύτταρα της ακτινωτής στεφάνου προδιαγράφοντας το αποτέλεσμα της ανάπτυξης ως το στάδιο της βλαστοκύστης (28).
Η αυτοματοποιήση του ICSI
Η εισαγωγή της ενδοκυτταροπλασματικής έγχυσης σπερματοζωαρίου (ICSI) το 1992 ήταν μια επανάσταση στην θεραπεία της ανδρικής υπογονιμότητας (29). Η αναλογία του ICSI vs IVF συνεχίζει να μεγαλώνει, σχετιζόμενο με καταστάσεις εκτός των παραγόντων ανδρικής υπογονιμότητας. (30), κάνοντάς το αναμφισβήτητα ένα από τα σημαντικότερα άλματα στην ART. Η μικρο-χείρηση των γαμετών απαιτεί έναν πεπειραμένο και υψηλής ειδίκευσης εμβρυολόγο και η διαδικασία θεωρείται εντατικού κόπου. Τα αποτελέσματα του εργαστηρίου από αυτήν την χειροκίνητη διαδικασία είναι ευαίσθητη σε ανθρώπινους παράγοντες όπως ο όγκος της δουλειάς, το άγχος και η κούραση όπως και οι παραλλάγες της διαδικασίας ανάλογα τον χειριστή. Είναι πιθανό αυτή η πιο εξελιγμένη τεχνική της ART να αυτοματοποιηθεί ολοκληρωτικά;
Σημαντικές πρόοδοι έχουν γίνει στα μικροηλεκτρομηχανικά συστήματα (MEMS) και στα micro-robotics. Η αυτό-έγχυση βιολογικών κυττάρων γίνεται ολοένα και περισσότερο στον τομέα των διαγονιδιακών (31) και της κυτταρικής βιολογίας (32), χρησιμοποιώντας αρχές που συνεπάγουν παρακουλούθηση, τοποθέτηση και έγχυση ενός υλικού μέσα στο κύτταρο.
Οι βελτιωμένες τεχνικές απόψεις περιλαμβάνουν συσκευές συγκράτησης κυττάρων βασισμένες στην MEMS και σε οπτικά «servo-control» συστήματα που κάνουν την ρομποτική μικρο-διαχείρηση μια δελεαστική προοπτική που ίσως πράγματι να προαναγγέλουν την εισαγωγή της αυτοματοποιήσης του ICSI στα εργαστήρια εξωσωματικής του μέλλοντος.
Πράγματι, ατο φως πρόσφατών μελετών πάνω σε πειραματικά μοντέλα ζώων, η εισαγωγή της ρομποτικής στο εργαστήριο εξωσωματικής ίσως κατασυχάζει ακόμη και τους ισχυρότερους σκεπτικιστές. Η Nano-Newton δύναμη αίσθησης και ο sub-pixel οπτικός έλεγχος έχουν αυξήσει την επιδεξιότητα και την ευαισθησία την διαχείρησης των εμβρύων και μικροέγχυσης των ωοκυττάρων στους μύες (33,34), ενώ το ωοκύτταρο και ο προσανατολισμός του πολικού σωματίου έχει επιτευχθεί μέσω της χρήσης μηχανοκίνητων σταδίων περιστρεφόμενων μικροσκοπίων, εντοπισμών μέσω υπολογιστή και πρότυπων αλγορίθμων αναγνώρισης. Ένα τέτοιο σύστημα μπορεί με ακρίβεια να προσανατολίσει τα ωοκύτταρα σε 7200 ανά δευτερόλεπτο με ακρίβεια των 0,240 (35). Η ρομποτική ακινητοποίηση και η μικρο-διαχείρηση των σπερματοζωαρίων είναι επι του παρόντος πιθανή σε 6-7 δευτερόλεπτα με την χρήση αλγορίθμων ταχύτητας και πορείας σπέρματος που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση σπέρματος μέσω υπολογιστή. (CASA)(36).
Στην πρώτη αναφορά του robotic ICSI (RICSI), χρησιμοποιώντας ωοκύτταρο μυός/ανθρώπινο μοντέλο σπέρματος, το ρομποτικό σύστημα έδειξε μέγαλη επιτυχία όπως επίσης και μεγάλο ποσοστό βιωσιμότητας περίπου 90% (37). Ηδη γίνονται προσπάθειες όσον αφορά το RICSI- robotic intracytoplasmic sperm injection (Yu Sun personnel communication), και ίσως είναι μόνο θέμα χρόνου πριν μια τέτοια αυτοματοποιήση κερδίσει την ευρεία εμπιστοσύνη της κοινότητας IVF.
Εικόνα 3. Αυτοματοποιημένο σύστημα διαχείρισης σπερματοζωαρίου και έγχυσής του στο ωοκυττάρο μέσω ρομποτικού συστήματος-μοντέλο (RICSI – robotic intracytoplasmic sperm injection). Η εισαγωγή των φωτογραφιών είναι με την άδεια του Καθηγητή Yu Sun, University of Toronto.
Όπως και με όλους τους επιστημονικούς κλάδους, η ART είναι βασισμένη στην συνεχή ανάπτυξη και εξέλιξη των αναδυόμενων τεχνολογιών. Περιττό να πούμε ότι, είναι καθήκον να διεξαχθούν αυστηρώς ελεγχόμενες προσπάθειες ωστέ να αποδειχθεί οτι οι μελλοντικές μεθοδολογίες θα παρέχουν μια εύρωστη, αξιόπιστη και ρεαλιστική προσθήκη στα εργαστήρια IVF του μέλλοντος.
Bibliography
1. Pool TB. Development of culture media for human reproductive technology. Fert Steril 2004:81;2:287-289
2. Bolton, V.N., Wren, M.E. and Parsons, J.H. (1991) Pregnancies after in vitro fertilisation and transfer of human blastocysts. Fertil. Steril; 55: 830–832.
3. Leese, H.J. Metabolism of the preimplantation mammalian embryo. Oxf. Rev. Reprod. Biol., 1991;13:35–72.
4. Quinn, P, Kerin J.F, Warnes, G.M. Improved pregnancy rates in human in vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fluid. Fertil Steril 1985;44:493–498.
5. Gardner DK, M Lane M. Culture of viable human blastocysts in defined sequential serum-free media. Hum. Reprod 1998; 13 (3): 148-159.
6. Richter KS. The importance of growth factors for preimplantaion embryo development and in vitro culture. Current opinion in obstetrics and gynecology 2008; 20:292-304.
7. Jackson RA, Gibson KA, Wu YW, Croughan MS. Perinatal outcomes in singletons following in vitro fertilization: a meta analysis. Obstet Gynecol. 2004;103(5):51-53.
8. Hardy K, Spanos S. Growth factor expression and function in the human and mouse preimplantation embryo. J Endocrinol 2002;172: 221-236.
9. Sjoblom C, Wikland M, Robertson SA.Granulosa-macrophage colony stimulationg factor promotes human Blastocyst development in vitro. Hum reprod 1999; 14:3069-3076.
10. Robertson SA, Sjoblom C, Jeasper MJ, Norman RJ, Seamark RF. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor promotes glucose transport and blastomere viability in murine preimplantation embryos. Biol reprod 2001; 64:1206-1215
11. Behr B, Mooney S, Wen Y .Prelimianry experience with low concentration of granulocyte macrophage colony stimulating factor: a potential regulator in preimplantation mouse embryo development.. Journal of assisted reproduction and genetics 2005; 22: 25-32
12. Wang H, Dasig D, Gebhardt J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating: factor: a regulator in preimplantation embryo development and apoptosis?. Fertil Steril 2002;77: S7
13. Sjoblom C, Roberts CT, Wikland M, Robertson SA. Granulocyte-macrophage Granulocyte-Macrophage Colony colony-stimulating factor alleviates adverse consequences of embryo culture on fetal growth trajectory and placental morphogenesis. Endocrinology 2005;146 (5): 2142 2005
14. Gardner DK, Lane M. Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biol Reprod 1993;48:377-385
15. Johnson M H. and Nasr-Esfaharu M.H. Radical solutions and cultural problems could free oxygen radicals be responsible for the unpaired development of preimplantatjonal mammalian embryos in vitro. BioEssays;1994 (16) 31-38.
16. Fukui Y, Lee ES, Araki N. Effect of medium renewal during culture in two different culture systems on development to blastocysts from in Vitro produced early bovine embryos. J Anim Sci 1996; 74:2752-2758.
17. Matsuura K, Hayashi N, kuroda Y, Takiue C, Hirata R, Takenami M, Aoi Y, Yoshioka N, Habara T Mukaida T, Naruse K. Improved development of mouse and human embryo using a tilting embryo culture system. Reprod biomed Online 2010;20:3: 358-364.
18. Koike T, Matsuura K, Naruse K, Funahashi H. In vitro culture with a tilting device in chemically defined media during meiotic maturation and early development improves the quality of blastocysts derived from in-vitro matured and fertilized oocytes. J Reprod Dev 2010; 56 (5): 552-7
19. Krika LJ. Miniaturization of analytical systems. Clin Chem 1998; 44:2008-2014
20. Mizuno J, Ostrovidov S, Nakamura H, Inui H. Development of microfluidic embryo culture system for human ART and human embryo culture. Fertil Steril 2005; 84:1: s403.
21. Mizuno J , Ostrovidov S, Sakai Y, Fujii T, Nakamura H, Inui H. Human art on a chip: improved human blastocyst development and quality with IVF chip. Fertil Steril 2007; 88:1:S101.
22. Suh RS, Zhu X, Phadke N, Ohl D, Takayama S, Smith GD. IVF within microfluidic channels requires lower total numbers and lower concentrations of sperm. Hum. Reprod. 2006; 21:2:477-483.
23. Swain JE, Pool TB, Takayama S and Smith G. Texbook of Assisted Reproductive Technologies, third ed. 2009 (informa UK Ltd); Microfluidics in ART: current progress and future directions: 843-858.
24.Kim L, Toh YC, Voldman J et al. A practical guide to microfluidic perfusion culture in adherent mammalian cells . Lab Chip 2007;7:681-94
25. Cabrera L.M. , Heo Y.S. , . Ding J, Takayama S. Smith G.D. Improved blastocyst development with microfluidics and Braille pin actuator enabled dynamic culture. 2006 Fertil Steril 2006;86; S43
26. Heo Y.S., Cabera L.M, Bormann C.L, Shah C.t., Takayama S Smith G.D.. Dynamic microfunnel culture enhances mouse developmemt and pregnancy rates. Hum Reprod 2010; 25 (3): 613-622.
27. Park J, S Jung, Y Kim, B Kim, S Lee and J.O Park. Design and fabrication of a integrated cell processor for single embryo cell manipulation. Lab chip 2005;5:91-96
28. Han C, Zhang Q, Ma R, Xie L, Qiu T, Wang L, Michelson K, Wang J, Huag G, Qiao J, Cheng J. Lab. Intergration of single oocyte trapping, in vitro fertilization and embryo culture in a micro-well-structured microfluidic device chip. 2010;10(21):2848-54
29.Devroey and Van. A review of ten years experience of ICSI. Hum Reprod. Update 2004;10:19-28
30. Jain T and Gupta RS. Trends in the use of Intracytoplasmic sperm injection in the United States. N Engl J Med 2007; 357:3:251-257.
31. Sun Y. Biological Cell Injection Using an Autonomous MicroRobotic System. The International Journal of Robotics Research (IJRR) 2002; 21:10-11: 861-868.
32. Wang WH, Liu XY, Gelinas D,. Ciruna B , Sun Y . A fully automated robotic system for microinjection of zebra fish embryos. PLoS ONE 2007; 2:862
33. Liu X, Kim K. Zhang Y and Sun Y. Nanonewton force sensing and control in microrobotic cell manipulation.International Journal of robotics research (IJRR) 2009;8:1065-1076
34. Liu X, Fernandes R, Juriscova A, Casper RF and Sun Y. In situ mechanical characterization of mouse oocytes using a cell holding device. Lab Chip 2010; 10:2154-2161
35. Liu X, Lu Z, Sun Y. Orientation Control of biological cells under inverted microscopy. IEEE/ASME.Transactions on mechatronics 2010; 99:1-7
36. Leug C, Lu Z, Effandiari N, Casper RF, Sun Y. 2010 Automated sperm immobilization for Intracytoplasmic sperm injection IEEE Transactions on biomedical enginnerring 2011; 58. (4 ); 935-942
37. Lu Z, Zhang X, Leung C, Esfandiari N, Casper R, Sun Y. Robotic ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection). 2011; [Epub ahead of print] IEEE Trans Biomed Eng
